Sekwencjonowanie DNA – cel, etapy i metody badania

Sekwencjonowanie DNA to bardzo przydatna technika biologii molekularnej pozwalająca na określenie kolejności nukleotydów w DNA. Dzięki temu możliwe jest poznanie genów lub całego genomu wszystkich organizmów. Sekwencjonowanie DNA znajduje zastosowanie w medycynie – pozwala na diagnozowanie niektórych schorzeń genetycznych, a także opracowanie spersonalizowanych terapii. Proces możliwy jest dzięki automatycznym sekwenatorom, dzięki czemu badanie cechuje się dużą szybkością i wydajnością.

Co to jest sekwencjonowanie DNA?

DNA, czyli kwas deoksyrybonukleinowy to wielocząsteczkowy związek organiczny zbudowany z deoksyrybonukleotydów. Związek ten jest nośnikiem informacji genetycznej organizmu, określanej dzięki zasadom azotowym tworzącym sekwencję DNA. Co to jest? Mianem sekwencji DNA określana jest kolejność występowania nukleotydów w jednej nici DNA. Sekwencję tę tworzą zasady azotowe – adenina A, cytozyna C, guanina G i tymina T, tworzące cztery typy nukleotydów. To, w jakiej kolejności te nukleotydy występują w nici DNA, determinuje rodzaj informacji genetycznej, czyli kod genetyczny. Jego dokładne poznanie jest możliwe dzięki sekwencjonowaniu.

Na czym polega sekwencjonowanie DNA? Każda trójka nukleotydów koduje jeden aminokwas, z kolei aminokwasy te tworzą białka, stanowiące cząstki budulcowe i funkcjonalne organizmu. Poznanie kolejności występowania zasad azotowych w DNA pozwala na dokładne określenie budowy białek i zdefiniowanie ewentualnych nieprawidłowości w budowie białka. A takie defekty białkowe leżą u podłoża wielu schorzeń. Sekwencjonowanie DNA polega na ustaleniu kolejności nukleotydów przy wykorzystaniu rozmaitych technik. Pierwszy raz sekwencjonowania DNA dokonano w 1977 roku, a naukowcem, któremu się to udało był  Frederick Sanger. Wówczas sekwencjonowanie wykonane zostało techniką terminacji łańcucha. Taka metoda wykorzystywana jest do dzisiaj i określana jest jako sekwencjonowanie DNA metodą Sangera. Sekwencjonowania DNA można dokonać także przy pomocy innych metod, takich jak sekwencjonowanie Maxama Gilberta.

Sekwencjonowanie DNA – zastosowanie w medycynie

Sekwencjonowanie DNA stosuje się w celu określenia zmian w kolejności nukleotydów kodujących białka. Dzięki temu możliwe jest zdiagnozowanie rzadkich chorób genetycznych. Sekwencjonowanie metodą Sangera umożliwia np. potwierdzenie mutacji w genie FBN1 – odpowiedzialnej za rozwój zespołu Marfana. Sekwencjonowanie DNA znajduje zastosowanie także w onkologii, umożliwiając m.in. opracowywanie indywidualnych terapii. Przykładem takiego leczenia jest terapia celowana ukierunkowana na receptor HER2, stosowana u pacjentek z rakiem piersi. Kolejny przykład to sekwencjonowanie mutacji genów BRCA1 i BRCA2 – wskazujących na wyższe ryzyko wystąpienia dziedzicznego raka piersi.

Tylko w wybranych laboratoriach może być przeprowadzone sekwencjonowanie DNA. Cena badania to około 1500–1900 zł. Na koszt procedury wpływ ma m. in. wykorzystywana technika.

Sekwencjonowanie metodą Sangera

Sekwencjonowanie Sangera to metoda terminacji łańcucha. Wykorzystywana jest możliwość zahamowania wydłużania nici nowo syntetyzowanego DNA, co odbywa się dzięki wykorzystaniu dideoksynukleotydów. Nie posiadają one grupy hydroksylowej, przez co nie jest możliwe utworzenie wiązania fosfodiestrowego. W tej metodzie matrycą do sekwencjonowania jest jednoniciowy DNA, a procedura wymaga użycia czterech różnych reakcji, dla każdego nukleotydu osobno. W takim sekwencjonowaniu DNA etapy procedury to:

• wyodrębnienie homogennego DNA z badanego materiału biologicznego;
• denaturacja DNA w celu otrzymania pojedynczej nici;
• przyłączenie starterów dla polimerazy DNA, czyli oligonukleotydów komplementarnych do matrycy, dzięki czemu syntetyzowana jest komplementarna nić DNA; na tym etapie wykorzystywane są dideoksynukleotydy oraz starter; w efekcie powstają fragmenty nici o różnej długości, odpowiadającej położeniu poszczególnych nukleotydów w nici;
• rozdział uzyskanych fragmentów nici DNA na żelu poliakrylamidowym i wyznaczenie sekwencji.

Modyfikacją metody Sangera jest sekwencjonowanie cykliczne, pozwalające na przyspieszenie procedury. W tej technice różnica sprowadza się do sposobu syntezy DNA – wykorzystywana jest reakcja łańcuchowej polimerazy PCR.

Sekwencjonowanie Maxama Gilberta

Sekwencjonowanie Maxama Gilberta to inaczej sekwencjonowanie z wykorzystaniem chemicznej degradacji DNA. Najpierw koniec 5’ DNA oznaczany jest przy pomocy promieniotwórczego izotopu. W kolejnym etapie reakcji nić DNA jest degradowana z wykorzystaniem czterech różnych odczynników. Ponieważ w łańcuchu wielokrotnie występuje każda z zasad, otrzymywane są fragmenty o różnej długości. W końcowym etapie procedury fragmenty te są rozdzielane na drodze elektroforezy na żelu.

Pirosekwencjonowanie DNA

Pirosekwencjonowanie – w przeciwieństwie do dwóch uprzednio omówionych metod – nie wymaga rozdzielania nici na fragmenty. Najpierw konieczne jest uzyskanie jednoniciowej matrycy z wykorzystaniem reakcji PCR. W kolejnym etapie przeprowadzana jest hybrydyzacja tej matrycy z primerem znakowanym biotyną, a następnie inkubacja z odpowiednimi związkami (enzymy oraz substraty reakcji). Następnie dodawany jest jeden z trifosforanów deoksyrybonukleozydów, który przyłącza się komplementarnie do jednoniciowej nici, a ilość uwalnianego w tej reakcji pirofosforanu jest proporcjonalna do liczby przyłączonych nukleotydów. W efekcie konwersji uwolnionego pirofosforanu pod wpływem odpowiedniego enzymu dochodzi do emisji kwantu światła. Jest to w pełni sekwencjonowanie automatyczne.

Sekwencjonowanie NGS

NGS, czyli Next Generation Sequencing, to Sekwencjonowanie Nowej Generacji. Wyróżnia się ogromną szybkością i wydajnością, dlatego określane jest jako sekwencjonowanie równoległe – pozwala na jednoczesne sekwencjonowanie milionów fragmentów DNA. Tutaj także najważniejszymi etapami procedury jest powielenie nici DNA, sekwencjonowanie oraz analiza.

Źródła:

1. Ahmadian A., Ehn M. and Hober S., Pyrosequencing: history, biochemistry and future, „Clinica Chimica Acta”, 2006, 363:83–94.
2. Matyjasik J., Masojć B. and Kurzawski G., Analizy molekularne DNA i RNA w wykrywaniu dziedzicznych predyspozycji do nowotworów, „Postępy Nauk Medycznych”, 2008, 7:431–440.